Cette fiche de lecture présente la technique Hugh & Leifson pour déterminer le métabolisme oxydatif ou fermentatif du glucose chez les bactéries et ainsi identifier leur voie de dégradation du glucose.
But
Cette technique permet la détermination du métabolisme oxydation ou fermentatif de la bactérie, autrement dit : dégrade-t-elle le glucose via le cycle de Krebs (= aussi appelé cycle de l’acide citrique par anglicisme, est une voie métabolique présente chez tous les organismes aérobies et dont la fonction première est d’oxyder les groupes acétyle, issus notamment de la dégradation des glucides, des graisses et des protéines) ou utilise-t-elle une autre voie ? Elle permet de connaître la voie de dégradation du glucose c’est-à-dire son type métabolique.
Principe
Le métabolisme des bactéries est recherché dans les ressources de Hugh & Leifson auxquelles on ajoute du glucose. Régénération du milieu (le milieu a été stocké trop froid pour que le gaz dissous dans le milieu puisse s’en échapper). Par conséquent, il présente un gradient de concentration en oxygène (la teneur en oxygène en surface est supérieure à la teneur en oxygène en profondeur). Les bactéries qui utilisent le glucose produisent de l’acide. Le produit acide est décrit par le changement de couleur du bleu de bromothymol, qui est un indicateur de couleur du pH contenu dans le milieu. A la fin de l’incubation, on observe le changement de couleur du milieu pour déterminer le type d’oxyde ou de fermentation.
Composition du milieu Hugh & Leifson
- Tryptone (2 g)
- Bleu de bromothymol (30 mg)
- Chlorure de sodium (5 g)
- Hydrogénophosphate de potassium (0,3 g)
- Agar-agar (2,5 g)
Mode opératoire
- Nous utilisons une culture propre pour éviter des résultats déformés.
- Régénérer à 100°C pendant 30 minutes en dévissant un petit peu le bouchon pour laisser l’air s’échapper.
- Laisser refroidir le milieu jusqu’à ce qu’il durcisse (par exemple, gagner du temps avec un robinet d’eau froide).
- Utiliser une pipette pasteur fermée pour ensemencer le tube à essai en faisant une piqûre centrale profonde.
- Viser partiellement le bouchon du tube pour laisser l’oxygène pénétrer dans le tube à essai.
- Incuber à 37°C pendant 24 heures à 48 heures.
Lecture et interprétation
On observe le changement de couleur du milieu. Si le milieu passe au jaune, l’indicateur de pH réagit à l’acidification et indique une fermentation du glucose; si le milieu reste vert (pH neutre), la souche est inerte vis-à-vis du glucose. La présence d’un changement de couleur dans la partie supérieure ou tout au long du tube permet de déduire si l’utilisation du glucose est oxydative ou fermentative.
Les ajustements et observations possibles incluent:
- Virage de l’indicateur de pH au jaune dans tout le tube : les bactéries sont fermentatives vis-à-vis du glucose.
- Virage de l’indicateur de pH au jaune dans la partie supérieure du tube : les bactéries sont oxydatives vis-à-vis du glucose.
- Le milieu reste tel qu’il était avant ensemencement : pas d’utilisation notable du glucose.
Interprétation expérimentale et métabolisme
De l’étude du métabolisme énergétique il découle que un glucide peut être catabolisé par voie respiratoire ou par voie fermentative. Le milieu de Hugh et Leifson permet de distinguer entre les deux processus. Lors des fermentations, le glucide est oxydé en acides et alcools, qui sont libérés dans le milieu et acidifient sensiblement celui-ci. Le milieu est régénéré en le chauffant au bain-marie bouillant, puis on remet l’éprouvette en étuve.
Le bleu de bromothymol prend une couleur jaune en milieu acide, ce qui signale une fermentation du glucose. En revanche, une absence de modification indique une absence d’utilisation du glucose ou une voie oxydative sans acidification suffisante.
Notes et observations supplémentaires
Le milieu peut contenir des éléments d’indicateur et des réactifs supplémentaires dans d’autres variantes du protocole Hugh & Leifson, comme des traitements qui révèlent la production éventuelle d’acétoïne, de butanediol ou d’autres produits de fermentation, ou encore des tests complémentaires pour la b-galactosidase et d’autres enzymes. Des observations complémentaires peuvent indiquer des voies mixtes ou des productions spécifiques selon les capsides et les conditions de culture.
Référence au schéma des résultats diabetiques et à l’interprétation des couleurs peut aider à clarifier les résultats et à associer les motifs observés à des profils métaboliques typiques.
Recherche de la Voie d'Attaque du Glucose par ensemencement d'un milieu Hugh et Leifson
La conclusion générale est que lorsque les bactéries décomposent le glucose pour produire de l’énergie, elles peuvent suivre soit la voie oxydative, soit la voie fermentative. Le milieu de Hugh & Leifson est conçu pour distinguer ces deux processus et caractériser le métabolisme des souches. Le type de métabolisme caractérise le comportement des bactéries.
| Éléments du milieu | Rôle |
|---|---|
| Tryptone | Source protéique et nutritionnelle |
| Bleu de bromothymol | Indicateur de pH, vire au jaune en milieu acide |
| Chlorure de sodium | Stabilisation osmotique |
| Hydrogénophosphate de potassium | Contrôle du pH et tampon |
| Agar-agar | Support gélifiant |
Le test Hugh & Leifson permet donc de déterminer le caractère oxydatif ou fermentatif de la dégradation du glucose par une souche bactérienne et de préciser son profil métabolique.